La microscopía de campo oscuro es una técnica de iluminación especializada que saca provecho de la iluminación oblicua para mejorar el contraste en muestras que también son difíciles de ver de forma clara o nítidas bajo condiciones normales de ilumitunación en campo claro.

Figura 3. Condensador de campo oscuro
Figura 3. Condensador de campo oscuro

Todos nosotros estamos muy familiarizados con el aspecto y la visibilidad de las estrellas en una noche oscura, esto a pesar de sus enormes distancias de la tierra. Las estrellas pueden ser vistas por el marcado contraste entre su luz tenue y el cielo negro.

Este principio se aplica en campo oscuro (también llamado fondo oscuro) en microscopia, es un método sencillo y popular para hacer que los objetos no teñidos sean claramente visibles. Estos objetos suelen tener índices de refracción muy cerca al valor de su entorno y es difícil visionarlos en microscopía de campo claro convencional. Por ejemplo, muchos pequeños organismos acuáticos tienen un índice de refracción entre 1.2 y 1.4, lo que resulta en una diferencia óptica insignificante a partir del medio acuoso circundante. Estos son los candidatos ideales para la iluminación de campo oscuro.

La iluminación de campo oscuro bloquea el paso de la luz central, que normalmente pasa a través y alrededor de la muestra, lo que permite los rayos oblicuos pasar por todos los angulos y directamente hacia la muestra. La lente superior de un condensador Abbe simple de campo oscuro es esféricamente cóncava, permitiéndo que los rayos de luz emergentes desde todos los ángulos de su superficie forma un cono de luz invertido con un vértice centrado en el plano de la muestra. Si no hay ninguna muestra y la A.N. del condensador es mayor que la del objetivo, los rayo oblicuos se cruzan y no entran al objetivo debido a su oblicuidad. El campo de visión aparece oscura.

El objetivo/condensador (especial) ilustrados en la figura 3 tiene una gran A.N. que representa la microscopía de campo oscuro más sofisticado. El objetivo contiene un diafragma iris interno que se usa para reducir la A.N. del objetivo a valores por debajo del cono de luz invertido emitido por el condensador. El diseño del condensador de campo oscuro depende the espejos internos que proyectan un cono de luz libre de aberraciones sobre el plano de la muestra.

Cuando se pone una muestra sobre la preparación, especialmente sin teñir, los rayos oblicuos cruzan la muestra y se difractan, refractan y/o reflejan por discontinuidades ópticas (como membrana celular, núcleo y orgánulos internos) permitiéndo que éstos rayos tenues penetren en el objetivo, entonces en la muestra aparecen los organismos brillantes sobre un fondo oscuro.

Los candidatos ideales (muestras) para la iluminación de campo oscuro incluyen muchos organismos vivos acuáticos, diatomeas, pequeños insectos, hueso, bras, el pelo, las bacterias no teñidas, levaduras y protozoos. Muestras no biológicas incluyen minerales y cristales químicos, partículas coloidales, muestras de polvo de conteo, y las secciones delgadas de polímeros y materiales cerámicos que contienen pequeñas inclusiones, las diferencias de porosidad, o inclinaciones de índice de refracción. Se debe tener cuidado en la preparación de muestras para microscopía de campo oscuro debido a las características que se encuentran por encima y por debajo del plano de enfoque que también pueden dispersar la luz y contribuir a la degradación de la imagen. El espesor de la muestra y el espesor de portaobjetos de microscopio son también muy importantes y, en general, una muestra delgada es lo ideal para eliminar la posibilidad de objetos de difracción que pueden interferir con la formación de la imagen.

A continuación vemos en microscopio de campo oscuro como partículas diminutas de coloides salen de los eritrocitos después de varios días desde la extracción. El video está realizado con OPTIKA B-500TDK y OPTKAM PRO HDMI.

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